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　　2、A01H 5/00(2006.01) (54)发明名称 一个NLR类基因NLR1-V及其表达载体和应用 (57)摘要 本发明属于基因工程领域， 公开了一个NLR 类基因NLR1-V及其表达载体和应用。 具有NLR结 构域的基因NLR1-V的cDNA序列为SEQIDNO.1及 其编码的氨基酸序列为SEQIDNO.2。 该基因来 自小麦-簇毛麦易位系6VS/6AL南农9918的6VS染 色体臂上。 NLR1-V在抗白粉病小麦品种南农9918 中受白粉菌诱导表达增强。 通过瞬间表达将该基 因转化感病小麦品种扬麦158， 结果表明NLR1-V 的过量表达可以降低扬麦158的吸器指数。 因此， NLR1

　　5、达载体和应用。 背景技术 0002 小麦(Triticum aestivum)的整个生育期受到多种病虫的危害， 其中由小麦白粉 病菌(Blurmeria graminis f.sp.tritici， Bgt)侵染引起的小麦白粉病是小麦最严重的真 菌病害之一。 由于小麦白粉病菌生理小种多、 毒力变异快， 一旦产生新的毒性小种或小种种 群发生变化， 会导致小麦白粉病的大爆发， 给农业生产带来灾难性后果。 广谱、 持久抗病基 因的发掘和利用对白粉病防治具有重要意义。 0003 簇毛麦(Haynaldia villosa， 2n2x14， VV)携带的抗白粉病基因Pm21对小麦白 粉病具有广谱、 高抗

　　6、特性， 该基因定位于6V染色体短臂上。 南京农业大学细胞遗传研究所利 用四倍体圆锥小麦与二倍体簇毛麦杂交， 再与普通小麦回交多代后， 选育出了普通小麦-簇 毛麦6VS/6AL易位系， 将含有Pm21基因的6VS导入普通小麦。 普通小麦-簇毛麦6VS/6AL易位 系自1994年进入国内育种利用以来， 在白粉病常发区进行了多年种植， 对白粉病表现出了 广谱、 高抗特性， 以之为亲本已经选育出一批高抗白粉病的小麦新品种， 南农9918即选育出 的其中一个品种， Pm21在育种中得到广泛应用。 分析Pm21介导的广谱抗性机理和克隆其候 选基因对于利用基因工程手段培育具有白粉病广谱抗性的小麦品种具有重要

　　8、R1-V基 因插入pBI220的BamHI和StuI酶切位点间所得。 0010 所述的NLR类基因NLR1-V的表达载体在构建抗白粉病小麦品种中的应用。 0011 有益效果： 0012 本发明从小麦-簇毛麦易位系6VS/6AL南农9918的6VS染色体臂上克隆获得小麦中 克隆得到了一个NLR类基因NLR1-V及其所编码的蛋白质NLR1-V， 将其插入表达载体pBI220， 得到的该基因的过量表达载体导入感病小麦品种中， 可以提高感白粉病小麦品种对白粉病 的抗性。 NLR1-V的超量表达载体用于基因工程育种， 将其导入易感白粉病小麦品种中， 能够 获得具备白粉病抗性的小麦种质。 说明书 1/4

　　9、页 3 CN 106754960 A 3 附图说明 0013 图1 NLR1-V在抗白粉病南农9918中受白粉菌诱导表达 0014 图2 pBI220:NLR1-V超量表达载体图谱 0015 图3 与白粉菌互作的表达GUS基因的表皮细胞 0016 A图:白粉菌侵入GUS表达的表皮细胞后未形成吸器； B图:白粉菌侵入GUS表达的表 皮细胞后形成吸器； 其中， co:分生孢子； pp:侵入钉； ha:吸器； hy:菌丝 0017 图4 利用瞬间表达研究NLR1-V基因对吸器形成的影响和抗白粉病效应 具体实施方式 0018 实施例1小麦-簇毛麦易位系6VS/6AL南农9918中一个NLR类基因NLR

　　10、1-V的克隆 0019 小麦-簇毛麦易位系6VS/6AL南农9918是南京农业大学细胞遗传所育成的含有广 谱抗白粉病基因Pm21的小麦品种(公知公用， 陈佩度， 张守忠， 王秀娥， 王苏玲， 周波， 冯祎 高， 刘大钧.抗白粉病高产小麦新品种南农9918.南京农业大学学报,2002,25(4):1438- 1444)。 前期已经在南农9918的6VS上开发了多个6VS的转化序列， 进一步利用小片段插入易 位系NAU418将Pm21限定在6EST258和CINAU15之间， 并且在Pm21所在染色体区间还有 6EST243和6EST238两个标记(公知公用， Radiation-induced

　　12、en.de/barley/ viroblast.php)、 短柄草Brachypodium_distachyon/Info/ Index)的序列数据库进行Blastn比对分析， 分别提取出水稻、 大麦、 短柄草中位于6EST258 和CINAU15所在染色体区间的序列。 根据其中一个大麦的序列设计引物， 在南农9918受白粉 菌诱导的cDNA样品中进行扩增， 获得NLR1-V全长序列。 cDNA样品准备及扩增流程如下： 0021 具体流程如下： (1)将抗白粉病小麦南农9918的种子播于培养皿中发芽， 露白后移 栽到盆钵， 一叶期把从感白粉病

　　19、击到 小麦叶片的表皮细胞， 然后统计轰击NLR1-V细胞的白粉菌吸器指数与未轰击NLR1-V细胞的 白粉菌吸器指数， 明确目标基因是否具有白粉病抗病功能。 0028 载体DNA与金属微粒包裹的程序如下： 0029 制备钨粉： 称取30mg的钨粉于1.5ml eppendorf管中， 加入1ml 70酒精， 涡旋3- 5min后静置15min， 使钨粉完全沉淀。 12000rpm离心1min后弃上清。 加入1ml ddH2O水， 涡旋 混匀后， 离心弃上清(重复三次)。 最后加入500 l 50甘油涡旋混匀， 以备用。 0030 包裹子弹： 吸取5 l涡旋均匀的钨粉于1.5ml的eppendor

　　22、入的细胞。 因GUS基因表达的细胞经染色整个细胞呈现蓝 说明书 3/4 页 5 CN 106754960 A 5 色， 所以本研究以蓝色细胞作为NLR1-V的表达细胞。 0032 基因枪轰击程序如下： 剪下长约6cm的小麦幼苗叶片端部， 平行贴在载玻片上， 每 张玻片贴6片叶片左右。 基因枪使用PDS1000/He系统， 采用1350psi的可裂膜片， 线inHg。 轰击后将叶片置于垫有润湿滤纸的瓷盘内， 罩以打有小孔的保鲜膜， 保湿并透气， 18-20恢复培养4h后， 高密度接种白粉菌分生孢子。 接种48h后用GUS染液(配方为： 0.1mol/L Na2HPO4/NaH2PO4

　　23、缓冲液(pH7.0)， 含10mmol/L EDTA， 5mmol/L铁和亚铁氰 化钾， 0.1mg/ml X-Gluc， 0.1Triton X-100， 20甲醇)线天直至叶片变成白色为止， 最后利用浓度为0.6的考马斯亮蓝对白粉 菌孢子染色。 0033 实施例5NLR1-V抗病功能的分析 0034 白粉菌侵入小麦叶片表皮细胞后， 在表皮细胞中产生的指状物称为吸器。 吸器不 能正常产生是叶片细胞对白粉菌具有抗性的重要指标。 在GUS表达的细胞中， 吸器会被GUS 染色液染成蓝色， 在显微镜下容易辨认(图3)。 在GUS基因转化